Western blot feilsøking

Løs Western blot-problemene dine med disse feilsøkingstipsene, som dekker vanlige årsaker til intet signal, høy bakgrunn, flere bånd og mer.

1. Ikke noe signal
2. Høy bakgrunn.
3. Flere bånd.
4. Ujevne hvite "flekker" på flekken.
5. Svarte prikker på flekken.
6. Hvite bånd på en svart flekk.
7. Molekylvekt markørfelt er svart.

1. Hvorfor fungerer ikke Western blot??
2. Hvorfor er Western-flekken min smurt?
3. Vasker du etter blokkering av Western blot?
4. Hva forårsaker ikke-spesifikk binding i Western blot?
5. Hvordan kan jeg forbedre Western blot-resultatene mine?
6. Hvorfor bruker vi melk i Western blot?
7. Hva er trinnene for Western blotting?
8. Kan du overføre en Western blot??
9. Hvordan bekrefter du overføring av proteinbånd fra gel til membran i Western Blot-protokollen?
10. Hvor lenge kan du blokkere en Western blot??
11. Kan du blokkere en Western blot i løpet av helgen?
12. Hvor mange ganger kan du strippe en Western blot??

Hvorfor fungerer ikke Western blot??

Hvis du har for lite protein, hvis det primære antistoffet ikke har høy affinitet eller hvis det primære antistoffet er i en suboptimal fortynning, ser du ikke proteinet ditt. Alternativt, hvis du laster for mye protein, kan signal / støyforholdet øke og forårsake problemer med visualisering.

Hvorfor er Western-flekken min smurt?

Hva er årsaken til et utstryk i en western blot? Som du kan se fra ponceau-fargingen av overføringen, går det en smøre gjennom de første 7 banene. Prøvene er embryonale stamceller lysert av 2xLSB prøvebuffer, pipettering og koking. ... Tilsynelatende skyldes smøre for mange celler i en brønn.

Vasker du etter blokkering av Western blot?

Blokkering er et veldig viktig trinn i immunodeteksjonsfasen av Western blotting fordi den forhindrer uspesifikk binding av antistoff til blottingmembranen. Etter blokkering skylles flekken i vaskebuffer, vanligvis TBST, med forsiktig omrøring og i tilstrekkelig volum til å holde flekken nedsenket. ...

Hva forårsaker ikke-spesifikk binding i Western blot?

En av de vanligste årsakene til uspesifikke bånd er ufullstendig blokkering. Blokkerende buffere brukes til å forhindre primære og sekundære antistoffer i å binde seg til membranen, eller noe annet enn proteinet av interesse.

Hvordan kan jeg forbedre Western blot-resultatene mine?

Løsning

1. Reduser primær antistoffkonsentrasjon.
2. Reduser mengden total protein som er lastet på gel.
3. Juster forholdene for membranblokkering.
4. Øk antall vasker.
5. Bekreft spesifisiteten til antistoffet.
6. Blot med det sekundære antistoffet alene.
7. Hvis bånd utvikler seg, velg et alternativt sekundært antistoff.

Hvorfor bruker vi melk i Western blot?

Blokkering er et veldig viktig trinn i western blotting, da det forhindrer antistoffer å binde seg til membranen ikke spesifikt. Blokkering gjøres ofte med 5% BSA eller fettfri tørket melk fortynnet i TBST for å redusere bakgrunnen. ... Antistoffet kan fortynnes i en vaskebuffer, slik som PBS eller TBST.

Hva er trinnene for Western blotting?

Fem trinn er involvert i western blotting-prosedyre og deteksjonsanalyse, nemlig overføring, blokkering, primær antistoffinkubasjon, sekundær antistoffinkubasjon og proteindeteksjon og western blotting-analyse.

Kan du overføre en Western blot??

Med økende tid er det imidlertid en risiko for overoverføring (stripping, gjennomblåsing) av proteinene gjennom membranen, spesielt for lavere molekylvekt (<30 kDa) proteiner ved bruk av membraner med større porestørrelse (0,45 um). Arbeidsflyt av våt / tankelektrotransfer av protein for western blotting.

Hvordan bekrefter du overføring av proteinbånd fra gel til membran i Western Blot-protokollen?

Proteinoverføringsprotokoll

1. Forbered PVDF-membranen ved å fukte den i metanol i 30 sekunder og deretter suge den kort i destillert vann etterfulgt av 1X overføringsbuffer. ...
2. Sug filterpapir og svamper i overføringsbufferen i 10 minutter før overføringssmørbrødet monteres.

Hvor lenge kan du blokkere en Western blot??

Generelt bør maksimal blokkeringstid ikke overstige 2 timer ved romtemperatur, ellers kan proteiner byttes ut fra membranen. Fortynn det primære antistoffet til anbefalt konsentrasjon / fortynning i fersk blokkerende løsning (TBS og / eller PBS (PBS tabletter 524650-1EA) / 3% tørr melk uten fett).

Kan du blokkere en Western blot i løpet av helgen?

Sterke titerantistoffer fungerer best ved kort inkubasjon, og svake dekkantistoffer krever lengre inkubasjon (ved høyere konsentrasjon). Å la flekken være i blokkeringsbufferen over natten eller i løpet av helgen ved 4C gjør ikke vondt.

Hvor mange ganger kan du strippe en Western blot??

også mens vi prøver å fjerne de primære antistoffene, er det et poeng å merke seg at det er sannsynlighet for at du kan miste noe av proteinet du har festet eller overført på membranen, og det tilrådes derfor ikke å strippe membranen mer enn en gang.